CRISPR/Cas9 : comment marche cette méthode de biologie moléculaire ?

CRISPR/Cas9, système de défense bactérien, a été transposé pour une utilisation en laboratoire et est devenu une méthode révolutionnaire en biologie moléculaire. Comment fonctionne cette méthode ?

Schéma: structure cristalline de Cas9 dans le complexe avec l’ARN guide simple brin et l'ADN cible

Structure cristalline de Cas9 dans le complexe avec l’ARN guide simple brin (sgRNA) et l'ADN cible (target DNA). (Image : Nishimasu H et al./Wikimedia Commons, Licence CC)

CRISPR/Cas9 : le génie génétique atteint une nouvelle dimension

Dans le quotidien du laboratoire, les scientifiques sont régulièrement amenés à modifier l'ADN, par exemple pour étudier la fonction de certaines protéines. Il existe déjà diverses méthodes permettant ce que l'on appelle l'édition génomique, mais CRISPR/Cas9 est maintenant considérée comme la méthode de choix lorsqu'il s'agit de couper l'ADN à un endroit précis. La difficulté n'est pas de couper l'ADN - il existe pour cela des enzymes connues depuis longtemps - mais de le couper à un endroit précis. Le système de modification génomique a donc besoin, en plus d'un outil tranchant, d'un mécanisme de reconnaissance de la séquence cible d'ADN.

gRNA et Cas9 : reconnaître et couper

Les deux éléments qui constituent la base de la méthode CRISPR/Cas9 sont l'ARN guide (guide RNA ou gRNA, souvent appelé aussi single guide RNA, ARN guide simple) et la protéine Cas9 (CRISPR associated protein), la véritable « paire de ciseaux » génétique. Ces deux éléments forment un complexe. Le gRNA est synthétisé en laboratoire de manière à être complémentaire de la séquence d'ADN cible - il reconnaît donc la cible qui doit être coupée. Sa longueur est en général de 17 à 21 nucléotides, ce qui garantit que la séquence n'apparaît qu'une seule fois dans le génome et que l’ADN ne sera pas sectionné en dehors de la région souhaitée. Cependant, avant de pouvoir reconnaître et couper la séquence d’ADN, le complexe gRNA/Cas9 doit d'abord l'atteindre.

Motif PAM : sésame ouvre-toi

Les motifs PAM ne sont rien d'autre que de courtes séquences d'ADN qui sont reconnues par les protéines Cas. Dans le cas de Cas9, qui a été isolée à partir de la bactérie Streptococcus pyogenes, il s'agit de la séquence NGG, N pouvant être n'importe quel nucléotide. La protéine Cas9 se lie à un motif PAM et déroule l'hélice d'ADN à cet endroit - la séquence d'ADN est maintenant accessible et peut théoriquement être coupée.

Le fait que les motifs PAM ne comportent que quelques nucléotides est un avantage pour le génie génétique. Ces courtes séquences de nucléotides sont relativement fréquentes dans le génome, de sorte que l'on peut généralement trouver plusieurs PAM dans un même gène. La probabilité qu'un PAM se trouve à proximité de la séquence cible que l'on veut couper, est donc élevée. Pourtant, les motifs PAM ne se trouvent pas toujours exactement là où l'on souhaite couper l'ADN. En plus de Cas9, les scientifiques ont découvert de nombreuses autres protéines Cas, qui fonctionnent toutes de façon similaire mais ciblent des motifs PAM différents. Cela permet une modification du génome plus flexible et encore mieux ciblée.

 

Schéma du système CRISPR/Cas9

Le système CRISPR/Cas9. Ici, Cas9 a reconnu le PAM et a déroulé l'ADN. Puisque le gRNA est complémentaire de la séquence d’ADN cible, une coupure a été faite à travers les deux brins. (Illustration : Mariuswalter/Wikimedia Commons, Licence CC)

Comment l’ADN cible est débusqué

Le complexe gRNA/Cas9 explore l'ADN. Lorsque Cas9 reconnait un motif PAM de l'ADN, elle s'arrête et ouvre la double hélice. Si le gRNA ne correspond pas à la séquence rendue accessible, le complexe continue jusqu'à ce qu'il rencontre le motif PAM suivant. Mais si la séquence d'ADN et le gRNA sont complémentaires, un changement de conformation se produit dans la protéine Cas9. Elle devient active en tant que nucléase et coupe les deux brins d'ADN.

Réparation de l'ADN après la coupure

Le complexe gRNA/Cas9 a déroulé l'ADN et a coupé le double brin d'ADN après l'appariement des bases de gRNA avec l'ADN cible. La cellule répare l'ADN par jonction d'extrémités non homologues (à gauche ;  non-homologuous end joining) ou, si un gabarit (ADN donneur) est présent, par recombinaison homologue (à droite). Dans le premier cas, des mutations peuvent se produire, ce qui peut conduire à l'inactivation souhaitée du gène. Dans le second cas, un gène étranger peut être introduit. (Illustration : Mariuswalter/Wikimedia Commons, Licence CC)

Et après la coupure ?

Cette coupure provoque une cassure double brin dans l'ADN, que la cellule tente de réparer le plus vite possible à l'aide de ses propres mécanismes de réparation (ce que l'on appelle jonction d'extrémités non homologues). Cependant, cette réparation est souvent accompagnée de petites erreurs qui font que l'ADN est souvent restauré sous une forme légèrement modifiée (des paires de bases peuvent être retirées ou ajoutées). Cette réparation incorrecte a pour conséquence une séquence d'ADN modifiée.

Et qu'est-ce que cela apporte ?

Ce type d’édition génomique est souvent utilisé pour inactiver complétement des gènes, car la modification de quelques paires de bases peut suffire à rendre la protéine codée par un gène inactive. Pour d'autres applications, une séquence d’ADN servant de modèle pour la réparation peut être introduite dans la cellule, afin qu'une partie d'un gène ou le gène entier puisse être remplacé de façon ciblée par un autre. On parle alors de recombinaison homologue. Des exemples d'application sont donnés dans l'article « CRISPR/Cas : une méthode, de nombreuses applications ».

 

CRISPR/Cas9 : c’est quoi ce nom ?

Le terme CRISPR vient d'un mécanisme de défense bactérien* et désigne des morceaux d'ADN définis, qui n'existent pas dans l'outil utilisé au laboratoire. Toutefois, ce terme est utilisé dans le nom de la méthode. Cas9 désigne l'enzyme qui coupe l'ADN. Dans l'article, nous faisons parfois référence au complexe gRNA/Cas9, ce qui nous semble un peu plus plausible dans ce contexte. On parle fréquemment de la méthode CRISPR/Cas9, mais de nombreuses autres enzymes Cas ont été découvertes entre-temps.

*La méthode CRISPR/Cas9 est basée sur un mécanisme adaptatif de défense des bactéries. Les bactéries utilisent ce mécanisme pour inactiver des virus dangereux (bactériophages) et se constituer une sorte de « mémoire » leur permettant de se défendre plus rapidement contre des infections répétées. Ce mécanisme est donc comparable à notre système immunitaire, mais de structure beaucoup plus simple.

La première publication scientifique présentant la méthode CRISPR/Cas9 provient du laboratoire des chercheuses Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna. Il se murmure que cette découverte mériterait un prix Nobel.

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