DNA kopieren – Mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Für die bahnbrechende Methode, mit der die Erbsubstanz, also die DNA, vervielfältigt werden kann, erhielt der amerikanische Biochemiker Kary Mullis 1993 den Nobelpreis für Chemie. Die Polymerase-Kettenreaktion (englisch Polymerase Chain Reaction: PCR) ist aus dem Labor heute nicht mehr wegzudenken. Eine Vielzahl an Untersuchungen, Nachweismethoden und Experimenten beginnen mit einer PCR. Das Ziel einer PCR ist, grosse Mengen eines bestimmten Abschnitts der DNA zu gewinnen, um diese nachzuweisen, oder um mit ihnen weiterzuarbeiten.

Ein Thermocycler.

Ein Thermocycler. Dieser Apparat sorgt für die richtige Temperatur während der PCR-Reaktion. Die kleinen Plastikgefässe enthalten alle Zutaten, die für die Vervielfältigung von DNA gebraucht werden. Bild: Nikita G. Sidorov/Shutterstock.com

Die PCR steht am Anfang vieler Laboruntersuchungen

Mit der PCR wird ein kurzer, genau definierter Teil eines DNA-Doppelstrangs in vitro, das heisst ausserhalb eines Organismus, vervielfältigt. Dabei kann es sich um ein Gen, um einen Teil eines Gens oder auch um nicht-kodierende DNA-Sequenzen handeln. Die PCR wird in biologischen und medizinischen Laboratorien eingesetzt, um grosse Mengen von definierten DNA-Abschnitten zu bekommen, die in weiteren Verfahren verwendet werden: Vaterschaftstests, der Nachweis bestimmter genetischer Erkrankungen oder Virusinfektionen, die Klonierung von Genen, ja sogar der Nachweis gefälschter Lebensmittel, alle diese Verfahren beginnen mit einer PCR. Die PCR ist auch die Grundlage für die DNA-Sequenzierung.

Um die DNA zu kopieren braucht es vier „Zutaten“

Diese vier Zutaten sind: DNA, Primer, Nukleotide und das Enzym DNA-Polymerase. Zuerst muss man die DNA, von der man einen Abschnitt vervielfältigen möchte, isolieren .

Hier kannst du selber DNA aus Tomaten isolieren.

Die Polymerasen-Kettenreaktion

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Dann braucht man zwei kurze einzelsträngige DNA-Stücke (meistens um die 18-30 Nukleotide lang), die Primer, die komplementär zu der DNA-Sequenz vor und nach dem DNA Stück sind, das man kopieren möchte. Komplementär bedeutet, dass die Primer genau zu einem bestimmten Abschnitt der DNA passen (siehe dazu auch diesen Artikel). Dazu muss also die Sequenz vor und nach dem DNA Stück, welches kopiert wird, schon bekannt sein.

Die nächste wichtige Zutat sind künstlich hergestellte Nukleotide. Das sind die Einzelbausteine (Monomere), aus denen die DNA später zusammengesetzt wird. Es gibt vier verschiedene Nukleotide. Jedes besteht aus einem Phosphatrest, einem Zuckermolekül (Pentose) und einer von vier Basen: Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin.

Die letzte wichtige Zutat ist die DNA-Polymerase. Eine Polymerase ist ein Enzym, das die Fähigkeit hat, einzelne Moleküle (Monomere) zu einer Kette (Polymer) zu verknüpfen. Die DNA-Polymerase kann Nukleotide zu einem DNA Strang verknüpfen. Als Vorlage braucht sie stets einen DNA-Einzelstrang, damit sie weiss, in welcher Reihenfolge die Nukleotide verknüpft werden sollen. Die Primer dienen der DNA-Polymerase als Startpunkt, an dem sie mit der Arbeit beginnen kann. DNA-Polymerase kommt in allen Lebewesen vor und ermöglicht die Verdopplung der DNA.

Die Zutaten werden alle zusammen mit etwas wässriger Lösung in ein kleines Plastikgefäss gegeben. Dieses wird in einen Thermocycler gestellt, einen Apparat, der heizen und kühlen kann und so für die richtige Temperatur während der Reaktion sorgt.

Die Reaktion kann losgehen

Um die DNA zu vervielfältigen, muss der DNA-Doppelstrang zuerst erhitzt werden bis die Basenpaare auseinandergehen und sich der Doppelstrang in zwei komplementäre Einzelstränge auftrennt. Dies geschieht für einige Minuten bei etwa 96°C. Dieser Prozess wird Denaturierung genannt.

Im nächsten Schritt wird die Temperatur etwas reduziert, was den Primern erlaubt, spezifisch an die komplementäre Sequenz der Einzelstränge anzudocken (Primerhybridisierung). Die Wahl der Temperatur hängt von der Länge der Primer und von ihrer Sequenz ab. Wird die falsche Temperatur gewählt, docken die Primer an vielen falschen Stellen oder gar nicht an.

Infobox

Thermostabile Enzyme

Proteine gehen bei hohen Temperaturen kaputt. Deshalb ist es so gefährlich, wenn man für längere Zeit sehr hohes Fieber hat. Bei 96°C würde eine normale DNA-Polymerase zerstört werden. Im Labor werden deshalb spezielle Polymerasen, die von einem hitzeresistenten Bakterium stammen, verwendet – ein Beispiel ist die Taq-Polymerase. Die Taq-Polymerase hält hohe Temperaturen ohne Probleme aus.

Nach der Primerhybridisierung wird die Temperatur so eingestellt, dass die DNA-Polymerase optimal arbeiten kann (72°C). Sie bindet jeweils an ein Ende eines Primers und beginnt ihn an dieser Stelle zu verlängern, indem sie neue synthetische Nukleotide hinzufügt und diese zu einer wachsenden Kette verknüpft. Dafür benutzt sie den DNA-Einzelstrang, an dem der Primer angedockt ist, als Vorlage. Aus einem Einzelstrang entsteht somit ein Doppelstrang. Da beide DNA-Einzelstränge des ursprünglichen Doppelstrangs kopiert werden, entstehen schliesslich zwei Doppelstränge. Dieser Schritt wird Elongation genannt.

Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, wird die Temperatur wieder erhöht, damit sich die neu entstandenen Doppelstränge wieder auftrennen. Mit dem nächsten Temperaturzyklus beginnt der Prozess von neuem und die DNA wird exponentiell vervielfacht. Meistens besteht eine PCR aus 30-40 solcher Zyklen. Dann ist genug DNA kopiert worden, um damit weiterzuarbeiten.

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